Πέμπτη
22 Οκτωβρίου
2020

Doctor Vasiliadis

CoVID-19 fast test

XueFeng Wang ORCID iD: 0000-0001-8854-275X

Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgGCombined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/jmv.25727

Ανάπτυξη και Κλινική Εφαρμογή Ταχείας Ανάλυσης IgM-IgG Αντισώματος για τη Διάγνωση της Λοίμωξης SARS-CoV-2

Για την βιβλιογραφία παραπομπών ανατρέξετε στο Αγγλικό κέιμενο


Το ξέσπασμα της νόσου του κορωναϊού (COVID-19) στη συνέχεια εξαπλώθηκε σε όλη την Κίνα και σε περισσότερες από 20 άλλες χώρες. Αν και η δοκιμή RT-PCR του ιού (SARS-Cov-2) έχει γίνει η πρότυπη μέθοδος για τη διάγνωση της μόλυνσης από SARS-CoV-2, αυτά τα πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο έχουν πολλούς περιορισμούς. Επιπλέον, αναφέρθηκαν υψηλά ποσοστά ψευδών αρνητικών. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για μια ακριβή και γρήγορη μέθοδο δοκιμής για την ταχεία αναγνώριση μεγάλου αριθμού μολυσμένων ασθενών και ασυμπτωματικών φορέων για την πρόληψη της μετάδοσης του ιού και την ασφαλή θεραπεία των ασθενών. Έχουμε αναπτύξει έναν γρήγορο και απλό ανοσοπροσδιορισμό πλευρικής ροής, ο οποίος μπορεί να ανιχνεύσει IgM και IgG αντισώματα ταυτόχρονα σε σχέση με τον ιό SARS-CoV-2 σε ανθρώπινο αίμα μέσα σε 15 λεπτά που μπορούν να ανιχνεύσουν ασθενείς σε διαφορετικά στάδια μόλυνσης. Με αυτό το κιτ δοκιμής, πραγματοποιήσαμε κλινικές μελέτες για να επικυρώσουμε τις χρήσεις κλινικής αποτελεσματικότητάς του. Η κλινική ευαισθησία ανίχνευσης και η εξειδίκευση αυτής της δοκιμής μετρήθηκαν με τη χρήση δειγμάτων αίματος που συλλέχθηκαν από 397 PCR επιβεβαιωμένους ασθενείς με COVID-19 και 128 αρνητικούς ασθενείς σε 8 διαφορετικές κλινικές θέσεις. Η ευαισθησία δοκιμής ήταν 88,66% και η ειδικότητα ήταν 90,63%. Επιπλέον, αξιολογήσαμε αποτελέσματα κλινικής διάγνωσης που ελήφθησαν από διαφορετικούς τύπους δειγμάτων αίματος φλεβών και δακτύλων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μεγάλη συνάφεια ανίχνευσης με δείγματα από αίμα, ορό και πλάσμα του φλεβικού αίματος. Η συνδυασμένη ανάλυση IgM-IgG έχει καλύτερη χρησιμότητα και ευαισθησία σε σύγκριση με μια μεμονωμένη εξέταση IgM ή IgG . Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία διαλογή των φορέων SARS-CoV-2, συμπτωματικών ή ασυμπτωματικών, σε νοσοκομεία, κλινικές και εργαστήρια δοκιμών.

Εισαγωγή

Από τον Δεκέμβριο του 2019, εμφανίστηκε μια σειρά περιπτώσεων άγνωστης αιτίας πνευμονίας στο Wuhan, Hubei, Κίνα, με κλινικές παρουσιάσεις που μοιάζουν πολύ με ιική πνευμονία.  [1] Ακολούθως, η αλληλουχία παθογόνων γονιδίων επιβεβαίωσε ότι το μολυσμένο παθογόνο ήταν ένας νέος κοροναϊός, που ονομάζεται 2019 νέος κοροναϊός (2). Σε αντίθεση με τα προηγούμενα κρούσματα μόλυνσης από κοροναϊό στους ανθρώπους, το 2003, το SARS-CoV [3,4] και το 2012 MERS-CoV [5], η SARS-CoV-2 μόλυνση προκάλεσε τη νέα νόσου του coronavirus (COVID-19) που έχει εξαπλωθεί σε ολόκληρη την Κίνα και σε περισσότερες από 20 άλλες χώρες. [6]  Έχει αναφερθεί ως έκτακτο περιστατικό δημόσιας υγείας διεθνούς ενδιαφέροντος. [7] Η εκδήλωση αυτής της νόσου έχει προκαλέσει την κινεζική κυβέρνηση να λάβει δραστικά μέτρα για να περιορίσει την εκδήλωση, συμπεριλαμβανομένης της καραντίνας εκατομμυρίων κατοίκων στο Wuhan και άλλες πληγείσες πόλεις της Κίνας. Οι παρεμβάσεις σε επίπεδο χώρας περιλαμβάνουν την καθυστέρηση της επανένταξης στους εργασιακούς χώρους και την ενθάρρυνση των πολιτών να παραμείνουν στο το σπίτι και ούτω καθεξής . Ωστόσο, αυτές οι προσπάθειες περιορίζονται από ένα δύσκολο πρόβλημα: πώς να διαφοροποιήσετε τις περιπτώσεις COVID-19 από την υγιή. Για επιβεβαιωμένα κρούσματα COVID-19, τα κοινά κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνουν φλεγμονή, βήχα, μυαλγία ή κόπωση. [8] Τα συμπτώματα αυτά δεν είναι μοναδικές ιδιότητες του COVID-19, επειδή αυτά τα συμπτώματα είναι παρόμοια με εκείνα άλλων μολυσμένων από τον ιό ασθενειών όπως η γρίπη. [9] Χαρακτηριστικά, η μέθοδος με PCR, οι CT απεικονίσεις και ορισμένες αιματολογικές παράμετροι είναι τα κύρια εργαλεία για την κλινική διάγνωση της λοίμωξης. [10] Πολλά εργαστηριακά πειράματα δοκιμής έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμές δείγματα ασθενών για COVID-19 από Κινέζικα CDC, US CDC και άλλες ιδιωτικές εταιρείες. Το νουκλεϊνικό οξύ RT-PCR test καθιερώθηκε ως η τρέχουσα τυπική διαγνωστική μέθοδος διάγνωσης του COVID-19. Ωστόσο, αυτά τα κιτ δοκιμής PCR σε πραγματικό χρόνο υποφέρουν από πολλούς περιορισμούς: 1) Αυτά τα δοκιμάζουν σε μεγάλους χρόνους ανάκαμψης και είναι περίπλοκα στη λειτουργία. κατά κανόνα λαμβάνουν κατά μέσο όρο πάνω από 2 έως 3 ώρες για τη δημιουργία αποτελεσμάτων. 2) Οι δοκιμές PCR απαιτούν πιστοποιημένα εργαστήρια, ακριβό εξοπλισμό και εκπαιδευμένους τεχνικούς για να λειτουργούν. 3) Υπάρχουν ορισμένοι αριθμοί λανθασμένων αρνητικών για την RT-PCR του COVID-19. [11] Οι περιορισμοί αυτοί δεν είναι κατάλληλοι για χρήση στο πεδίο, αλλά και για την απλή διάγνωση και τον έλεγχο των ασθενών. Περιορίζει την προσπάθεια καταστολής των επιδημιών. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για μια γρήγορη, απλή στη χρήση, ευαίσθητη και ακριβή δοκιμασία για την ταχεία αναγνώριση των μολυσμένων ασθενών του SARS-CoV-2 για την πρόληψη της μετάδοσης του ιού και για την εξασφάλιση της θεραπείας των ασθενών.

Η δοκιμή συγκεκριμένων αντισωμάτων του SARS-CoV-2 στην εξέταση αίματος των ασθενών αποτελεί μια καλή επιλογή για ταχεία, απλή, εξαιρετικά ευαισθητοποίηση του COVID-19. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι το IgM παρέχει την πρώτη γραμμή ανοσοποίησης κατά τη διάρκεια ιικών λοιμώξεων πριν από τη δημιουργία προσαρμοστικών αποκρίσεων IgG υψηλής συγγένειας που είναι σημαντικές για μακροχρόνια ανοσία και ανοσολογική μνήμη. [12] Αναφέρθηκε ότι μετά από μόλυνση με SARS, σε αίμα ασθενούς μετά από 3 έως 6 ημέρες και IgG θα μπορούσε να ανιχνευθεί μετά από 8 ημέρες. [13,14] Επειδή το COVID-19 ανήκει στην ίδια μεγάλη οικογένεια ιών με αυτές που προκαλούν επιδημίες με το MERS και το SARS, υποθέτουμε ότι η διαδικασία δημιουργίας του αντισώματος είναι παρόμοια και η ανίχνευση του IgG και IgM αντίσωματος εναντίον του SARS-CoV-2 θα αναγνωρίσει την μόλυνση. Επιπλέον, η ανίχνευση αντισωμάτων IgM υποδεικνύει πρόσφατη έκθεση στο SARS-CoV-2, ενώ η ανίχνευση αντισωμάτων IgG από το COVID-19 υποδεικνύει την έκθεση του ιού πριν από λίγο καιρό. Επομένως, πιστεύουμε ότι η ανίχνευση IgM και IgG θα μπορούσε να παράσχει πληροφορίες για το χρονικό προσδιορισμό της μόλυνσης από ιούς. Η ταχεία ανίχνευση τόσο των IgM όσο και των IgG αντισωμάτων θα προσθέσει αξία στη διάγνωση και τη θεραπεία της ασθένειας COVID-19. Βάσει αυτών, αναπτύξαμε ένα προϊόν δοκιμής ανοσοπροσδιορισμού πλευρικής ροής (LFIA), το οποίο μπορεί να ανιχνεύει ταυτόχρονα IgM και IgG σε ανθρώπινο αίμα εντός 15 λεπτών. Εξετάσαμε το προϊόν σε 8 νοσοκομεία και το Κινέζικο CDC το οποίο επικυρώνει την κλινική του αποτελεσματικότητα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτή η ταχεία δοκιμασία αντισωμάτων έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε νοσοκομεία, κλινικές και εργαστήρια δοκιμών. Η δοκιμή μπορεί επίσης να αναπτυχθεί αποτελεσματικά σε επιχειρήσεις, σχολεία, αεροδρόμια, θαλάσσια λιμάνια και σιδηροδρομικούς σταθμούς κ.λπ., δίνοντάς της τη δυνατότητα να καταστεί μια αναγκαστική δύναμη στην καταπολέμηση αυτής της παγκόσμιας απειλής.

Μέθοδοι και υλικά

Τα υλικά για την παρασκευή της συνδυασμένης δοκιμασίας αντισωμάτων IgG-IgM αντισώματος COVID-19 Anti-ανθρώπινης IgG και IgM (LF201001, LF201002) αγοράστηκαν από την Nanjing Lefushidai Inc., αναπτύχθηκε COVID-19 ανασυνδυασμένο αντιγόνο (ΜΚ201027) και καθαρίστηκε στο Medomics. Το ανασυνδυασμένο αντιγόνο (ΜΚ201027) είναι περιοχή δέσμευσης υποδοχέα της πρωτεΐνης Spike SARS-CoV-2, η οποία είναι διαμεσολαβούμενη από παροδική κυτταροκαλλιέργεια και καθαρίζεται με χρωματογραφία συγγένειας πρωτεΐνης Α και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC). Ο σχεδιασμός του αντιγόνου βασίστηκε στην δημοσιευμένη αλληλουχία SARS-CoV-2. Αρκετά διαφορετικά σχέδια αντιγόνου δοκιμάστηκαν και βελτιστοποιήθηκαν. Τελικά, το ΜΚ201027 ελήφθη σε προϊόν δοκιμής. Η αλβουμίνη ορού βοδιού (BSA) και αντισώματα κατσίκας αντι-ανθρώπινης Ig Gand IgM, IgG κουνελιού και αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG ελήφθησαν από κολλοειδή νανοσωματίδια (AuNP) Sigma.40nm, μεμβράνη NC και πλαστική επιφάνεια ελήφθησαν από την Shanghai Kin Bio Inc., το συγκρότημα συζευγμένης υάλου από γυαλί (GFC) παρελήφθη από την Whatman. Ο αλατούχος φωσφορικός ρυθμιστικός διαλύτης αγοράστηκε από τη Sigma. Τα αδρανοποιημένα COVID-19 θετικά ορού και τα αρνητικά δείγματα ορού των ασθενών χορηγήθηκαν από την Hunan CDC, China.

Παρασκευή συζυγών AuNP
Για να παρασκευαστεί το συζυγές AuNP, ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη SARS-CoV-2 διαλυμένη σε PBS (1 mg / mL) προστέθηκε στο μίγμα 1 mL AuNP colloid (40nm σε διάμετρο, OD = 1) και 0,1mL βορικού ρυθμιστικού διαλύματος (0,1 Μ, ρΗ 8,5). Μετά από επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν στο διάλυμα 0.1ml από 10 mg / mL BSA σε PBS για να μπλοκάρει την επιφάνεια AuNP. Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 rpm και 4 ° C για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και 1mL 1 mg / mL BSA σε PBS προστέθηκαν στο συζυγές AuNP για επανεναιώρηση. Η διαδικασία φυγοκέντρησης και εναιωρήματος επαναλήφθηκε δύο φορές και το τελικό διάλυμα εναιωρήματος ήταν PBS. Τα συζεύγματα IgG-κουνελιού AuNP παρασκευάστηκαν και καθαρίστηκαν με την ίδια διαδικασία.

Παρασκευή της δοκιμασίας IgG-IgM
Για το COVID-19 Το κύριο σώμα της ταινίας δοκιμής αποτελείται από πέντε μέρη, συμπεριλαμβανομένης της πλαστικής βάσης, του μαξιλαριού δείγματος, του συζευγμένου μαξιλαριού, του απορροφητικού μαξιλαριού και της μεμβράνης NC . Κάθε συστατικό της λωρίδας θα πρέπει να λάβει μια προκατεργασία που περιγράφεται ως εξής: η μεμβράνη NC προσαρτήθηκε σε ένα πλαστικό στρώμα υποστήριξης για κοπή και χειρισμό. Το αντι-ανθρώπινο IgM, IgG αντι-ανθρώπινης IgG και αντι-κουνελιού ακινητοποιήθηκαν στις δοκιμασίες Μ, G και γραμμή ελέγχου (γραμμή C) αντίστοιχα. Το συζευκτικό υπόστρωμα ψεκάστηκε με μίγμα σύζευξης ανασυνδυασμένου αντιγόνου AuNP-COVID-19 και AuNP-IgG κουνελιού. Το υπόστρωμα δείγματος υποβλήθηκε σε προκατεργασία με BSA (3%, βάρος / όγκο) και Tween-20 (0,5%, β / ο) πριν από τη χρήση.


Έλεγχος των δειγμάτων COVID-19 με τη χρήση του συστήματος LFIA1)

1) Συλλογή ασθενών και δειγματοληψίας

Οι ασθενείς που προσλήφθηκαν συμμορφώνονταν με την ταξινομητική ακτινολογική εξέταση των υποψιών ότι η COVID-19 ήταν σύμφωνα με την οδηγία διάγνωσης και θεραπείας του COVID-1915, περιλαμβανομένου του τυπικού επιδημιολογικού ιστορικού και των κλινικών χαρακτηριστικών. Αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν από διάφορα νοσοκομεία και από τα εργαστήρια δοκιμών CDC (σύνολο 8) σε 6 διαφορετικές επαρχίες στην Κίνα. Οι δοκιμές διεξήχθησαν στις θέσεις από το κλινικό προσωπικό που ακολούθησε τη διαδικασία δοκιμής που περιγράφηκε στα ένθετα του προϊόντος. Το δείγμα αναπνευστικής οδού, περιλαμβανομένου του φαρυγγικού swaband πτυέλων, χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει COVID-19 περιπτώσεις και το αίμα, συμπεριλαμβανομένου του ορού και του πλάσματος, IgM και IgG αντισώματος.

2) Δοκιμασία δείγματος.

Πριν από τη δοκιμή, το δοχείο που αδειάζει ανοίχτηκε αμέσως πριν από τη χρήση. Όταν για τη δοκιμή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα αίματος ψυγείου, θερμάνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (15-30 ° C). Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, 20 μΐ δείγματος ολικού αίματος (ή 10 μΐ δείγματα ορού / πλάσματος) διοχετεύθηκε με σιφώνιο μέσα στη θυρίδα δειγμάτων ακολουθούμενο από την προσθήκη 2-3 σταγόνων (70-100 μΐ) ρυθμιστικού διαλύματος αραιώσεως (ρυθμιστικό διάλυμα PBS 10 mM) για την οδήγηση τριχοειδούς δράσεως κατά μήκος της ταινίας. Ολόκληρη η δοκιμή χρειάστηκε περίπου 15 λεπτά για να ολοκληρωθεί.

3) Εμφάνιση αποτελεσμάτων

Συνολικά υπάρχουν τρεις γραμμές ανίχνευσης. Η γραμμή ελέγχου (C) εμφανίζεται όταν το δείγμα έπεσε μέσα από το φυσίγγιο. Η παρουσία αντι-SARS-CoV-2IgM και αντι-SARS-CoV-2IgG θα υποδεικνύεται με μια κόκκινη / ροζ γραμμή δοκιμής στην περιοχή Μ και G.Παρακάτω η γραμμή ελέγχου (C) έδειξε κόκκινο, το δείγμα είναι αρνητικό. Είτε η γραμμή Μ είτε η γραμμή G ή και οι δύο γραμμές σε κόκκινο υποδεικνύουν αντι-SARS-CoV-2-IgM ή αντι-SARS-CoV-2-IgG ή και τα δύο αντισώματα στο δείγμα. Εάν η γραμμή ελέγχου δεν εμφανίζεται κόκκινη, η δοκιμή δεν είναι έγκυρη και η δοκιμή θα πρέπει να επαναληφθεί με άλλο φυσίγγιο.

Δειγματοληψία

Τα πειράματα ταχείας αντίδρασης με αντισώματα SARS-CoV-2IgG-IgM ελέγχθηκαν σε 8 νοσοκομεία και τα κινεζικά CDC laboratories σε διάφορες επαρχίες, με συνολικά 397 κλινικά θετικά και 128 κλινικά δείγματα αίματος αρνητικών ασθενών. Τα δεδομένα δοκιμής συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν. Η εξειδίκευση και η ευαισθησία των κιτ ταχείας δοκιμής υπολογίστηκαν σύμφωνα με τους ακόλουθους τύπους: Ειδικότητα (%) = 100 x [True negative / (True Negative + False Positive)]

Sensitivity (%) =100 x [True Positive/(True Positive + False Negative)]


Αποτελέσματα

Ο σχεδιασμός και το τελικό προϊόν του SARS-CoV-2rapid δοκιμής του συνδυασμένου κιτ αντισωμάτων IgG-IgM

Το συνδυασμένο kit αντισωμάτων IgG-IgM IgG-IgM του SARS-CoV σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε από την Jiangsu Medomics Medical Technologies, που βρίσκεται στο Nanjing της Κίνας. Είναι ένας ποιοτικός ποιοτικός ανοσοπροσδιορισμός για τον ταχύ προσδιορισμό της παρουσίας ή της απουσίας τόσο των αντι-SARS-CoV-2-IgM όσο και των αντι-SARS-CoV-2-IgG σε ανθρώπινα δείγματα (πλήρες αίμα, ορό και πλάσμα). Το κιτ δοκιμής συνοδεύεται από δοχείο δοκιμής, ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης δείγματος και ένθετο συσκευασίας. Η κασέτα δοκιμής έχει τρεις ζώνες ανίχνευσης, συμπεριλαμβανομένης μιας ζώνης απομακρυσμένου ελέγχου που εμφανίζεται όταν το δείγμα έφτασε στο τέλος της ταινίας δοκιμής. Η παρουσία αντισωμάτων SARS-CoV-2IgG και IgM υποδεικνύεται με κόκκινη / πορφυρή γραμμή στην συγκεκριμένη περιοχή που υποδεικνύεται στη συσκευή. Η συνδυασμένη δοκιμαστική ταινία αντισωμάτων IgG-IgM IgG-IgM, όπως φαίνεται στο σχήμα 1, έχει δύο αντισώματα επιφανείας από το SARS-CoV-2 τα οποία μπορούν να δεσμεύονται ειδικά με τα αντισώματα SARS-CoV-2 (συμπεριλαμβανομένων και των IgM και IgG) συζεύγνυνται με τα αντι-ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού (αντι-IgG και αντι-IgM) κολλοειδή νανοσωματίδια χρυσού και ψεκάζονται σε μαξιλάρια σύζευξης. Τα προϊόντα σύζευξης IgG AuNP-κουνελιού ψεκάστηκαν επίσης σε επιδέσμους σύζευξης για δέσμευση με IgG αντι-κουνελιού που ακινητοποιείται στη γραμμή ελέγχου (Σχήμα 1Α).

covid1.png

Κατά τον έλεγχο, προστίθενται 10-15ul του δείγματος στη θυρίδα δείγματος ακολουθούμενη από την προσθήκη αραίωσης δείγματος ρυθμιστή. Ο μηχανισμός της ανάλυσης βασίζεται στην ενυδάτωση και μεταφορά των αντιδραστηρίων καθώς αλληλεπιδρούν με το δείγμα κατά μήκος της ταινίας μέσω χρωματογραφικής πλευρικής ροής (Σχήμα 1 Α). Καθώς το δείγμα ρέει διαμέσου της συσκευής, τα αντισώματα αντι-SARS-CoV-2 IgG και IgM, εάν υπάρχουν στο δείγμα, δεσμεύονται από το επισημασμένο με SARS-CoV-2 αντιγόνο χρωματομετρικό αντιδραστήριο χρυσού που είναι στερεωμένο στο μαξιλάρι συζεύγματος. Καθώς το συζευγμένο δείγμα συνεχίζει να ταξιδεύει επάνω στη λωρίδα, τα αντισώματα αντι-SARS-CoV-2IgM δεσμεύονται στη γραμμή Μ (IgM) και τα αντισώματα αντι-COVID-19 IgG δεσμεύονται στη γραμμή G (IgG). Εάν το δείγμα δεν περιέχει SARS-CoV-2 αντισώματα, κανένα επισημασμένο σύμπλοκο δεν δεσμεύεται στη ζώνη δοκιμής και δεν παρατηρούνται γραμμές. Ο υπόλοιπος κολλοειδής χρυσός μετακινεί τη νιτροκυτταρίνη στη Ζώνη Ελέγχου, η οποία συλλαμβάνει την περίσσεια συζυγούς, αποδεικνύοντας ότι το υγρό έχει μεταναστεύσει επαρκώς μέσω της συσκευής. Μια κόκκινη-μοβ γραμμή θα εμφανιστεί στη Ζώνη Γραμμής Ελέγχου κατά την εκτέλεση όλων των έγκυρων δοκιμών το δείγμα είναι θετικό ή αρνητικό για τη μόλυνση με SARS-CoV-2. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, η περίσσεια αντιδραστηρίου περιλαμβανομένου του μεταγραφικού συζεύγματος IgG κουνελιού AuNP περνάει τη ζώνη γραμμής ελέγχου, όπου τα συζυγή IgG κουνελιού AnNP δεσμεύονται με IgG αντι-κουνελιού για να σχηματίσουν κόκκινη γραμμή στη γραμμή ελέγχου .

Στο σχήμα 1Β Δείχνει τα διάφορα αποτελέσματα των δοκιμών για αρνητικά, IgM θετικά, IgG θετικά και IgM / IgG και θετικές καταστάσεις.

covid1a.png

Όπως ένα παράδειγμα για να δείξει αποτελέσματα πραγματικών δοκιμών, το Σχήμα 2 δείχνει ένα αποτέλεσμα εξέτασης photofor 6 διαφορετικών δοκιμαστικών δοχείων από 6 ασθενείς που αντιπροσωπεύει διάφορους τύπους αποτελεσμάτων.

covid1ax.png


Στο φυσίγγιο # 13, η ανάγνωση φωτογραφίας παρουσιάζει ανίχνευση IgM και IgG. σε φυσίγγιο # 14 IgM μόνο σε χαμηλή συγκέντρωση. στο φυσίγγιο # 15, απουσία IgM και IgG. στο φυσίγγιο # 16 IgG μόνο σε χαμηλή συγκέντρωση, στη κασέτα #17 IgG μόνο σε υψηλή συγκέντρωση και σε φυσίγγιο #18, IgM μόνο σε υψηλή συγκέντρωση σε αίματα ασθενών, αντίστοιχα.

Η ευαισθησία ανίχνευσης και η εξειδίκευση του SARS-CoV-2IgG-IgM συνδυασμένου κιτ αντισώματος,

Προκειμένου να δοκιμαστεί η ευαισθησία ανίχνευσης και η εξειδίκευση της δοκιμής συνδυασμένου αντισώματος SARS-CoV-2IgG-IgM, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από τους ασθενείς COVID-19 από πολλαπλά νοσοκομεία και από τα Κινεζικά CDC laboratories. Η δοκιμή γίνεται ξεχωριστά σε κάθε τοποθεσία. Συνολικά εξετάστηκαν 525 περιπτώσεις: 397 (θετικές) κλινικά επιβεβαιωμένες (συμπεριλαμβανόμενων των δοκιμών PCR) ασθενών με SARS-CoV-2 και 128 μη μολυσμένων με SARS-CoV-2 ασθενών (128 αρνητικές). Τα αποτελέσματα της εξέτασης του αίματος φλέβας χωρίς εξωσωματική γονιμοποίηση συνοψίστηκαν στον Πίνακα 1. Από το δείγμα αίματος 397 από τους ασθενείς που είχαν μολυνθεί από SARS-CoV-2, 352 είχαν θετικό αποτέλεσμα, με αποτέλεσμα την ευαισθησία 88,66% . Δώδεκα (12) από τα δειγματα αίματος από τους ασθενείς που δεν είχαν μόλυνση, non-SARS-CoV-2, με αποτέλεσμα την εξειδίκευση της δοκιμασίας να είναι 90,63%. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι 64,48% (256 από τους 397) των ασθενών που είχαν προσβληθεί είχαν αντισώματα IgM και IgG (Πίνακας 1).

covid1axs.png

Για τη δοκιμή, είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τα δεδομένα της χρονικής στιγμής της μόλυνσης από κλινικά δείγματα τα οποία θα είναι χρήσιμα για να συγκρίνουμε τα δεδομένα ενός ή δύο θετικών στον Πίνακα 1. Λόγω περιορισμένου χρόνου, δεν έχουμε πλήρη λεπτομερή στοιχεία για το πόσο καιρό κάθε ασθενής μολύνθηκε ή για πόσο χρονικό διάστημα ο κάθε ασθενής είχε συμπτώματα όταν συλλέχθηκε δείγμα αίματος σε όλες τις κλινικές θέσεις. Είχαμε τέτοια δεδομένα μόνο από ένα κλινικό κέντρο νοσοκομείων στην πόλη Wuhan Red Cross. Ως αναφορά, αναλύοντας ένα υποσύνολο δεδομένων 58 ασθενών στο Wuhan, βρέθηκε ότι 94,83% των θετικών ασθενών είχαν τόσο θετικές γραμμές IgM όσο και IgG και 1,72%, 3,45% είχαν μόνο IgM ή μόνο θετικές IgG γραμμές αντίστοιχα (πίνακας 2 ). Ο χρόνος δοκιμής ήταν από την ημέρα 8 έως την ημέρα 33 μετά την εμφάνιση των συμπτωμάτων της λοίμωξης. Για το σκοπό αυτό χρειάζονται περαιτέρω μελέτες και συλλογή πληροφοριών για αυτό το τεστ αντισωμάτων.

covid1axss.png

SARS-CoV-2IgG-IgM σε διαφορετικούς τύπους δειγμάτων αίματος.

Τα παραπάνω αποτελέσματα επαλήθευαν την ευαισθησία και την εξειδίκευση του κιτ ανίχνευση σε αδρανοποιημένο αίμα. Εντούτοις, είναι πιο βολικό να συλλέγουμε το χέρι έξω από τα νοσοκομεία και τις κλινικές. Προκειμένου να επιτευχθεί μια απλούστερη διαδικασία λειτουργίας, ελεγχόταν η απόδοση του συνδυασμένου αντισώματος SARS-CoV-2IgG-IgM με περιφερικό αίμα. Δοκιμασμένο αίμα και φλέβα αίματος και φλέβας αίματος και φλέβας από τον ίδιο ασθενή.

Όπως έδειξαν στον Πίνακα 3, επτά ασθενείς COVID-19 και τρεις υγιείς εθελοντές προσλήφθηκαν. Πήραμε τα δείγματα αίματος από το δάκτυλο, τον ορό φλεβικού αίματος και το πλάσμα του φλεβικού αίματος και τα έλεγξ με τα κιτ. Μέσα στους 7 ασθενείς 3 ασθενείς είχαν μόνο IgM θετικό και 4 ασθενείς έχουν τόσο IgM όσο και IgG θετικούς. Όλοι οι υγιείς εθελοντές βρέθηκαν με αρνητικά αποτελέματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα θετικά και αρνητικά αποτελέσματα των δοκιμών αντιστοιχούσαν με 100% σύσταση στα αντίστοιχα δείγματα αίματος. Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει ότι το συνδυασμένο testkit του αντισώματος SARS-CoV-2IgG-IgM μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δοκιμή σημείου φροντίδας (POCT). Μπορεί να πραγματοποιηθεί στο αίμα με το δάκτυλο.

covid1axssd.png

 

Συζήτηση

Εδώ, αναπτύξαμε με επιτυχία ένα γρήγορο IgG-IgM συνδυασμένο κιτ ανίχνευσης αντισωμάτων για COVID-19 διάγνωση. Η ευαισθησία και η εξειδίκευση του κιτ επαληθεύτηκαν στο εργαστήριο και νοσοκομειακή πρακτική. Αυτό το κιτ παρέχει ένα προϊόν που ανταποκρίνεται στην επείγουσα ανάγκη για δοκιμές ανοσοπροσδιορισμού στα κινεζικά νοσοκομεία για τη διάγνωση του COVID-19. Προκειμένου να καταστούν οι κατάλληλοι για διαφορετικά στάδια της νόσου, αναπτύξαμε IgG-IgM συνδυασμένη δοκιμασία αντισωμάτων για την μόλυνση COVID-19 (Εικόνα 1). Επίσης, επιβεβαιώθηκε ότι η ευαισθησία ανίχνευσης ήταν υψηλότερη σε δοκιμασία συνδυασμένου αντισώματος IgG-IgM σε δοκιμασία αντισώματος individual IgG ή IgM (Πίνακας 1). Επομένως, συνιστούμε περισσότερο την ανάπτυξη IgG-IgM συνδυασμένου αντισώματος δοκιμής με τα ξεχωριστά κιτ δοκιμής αντισωμάτων IgG ή IgM αν υπάρχει ένα αξιόπιστο τεχνικό σύστημα είναι διαθέσιμο. Η δοκιμή (το τέστ) για την εξέταση COVID-19 σεασθενείς, έχει ευαισθησία 88,66% και εξειδίκευση 90,63%. Παρ 'όλα αυτά, υπήρχαν ψευδή θετικά και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα (Πίνακας 1). Οι λόγοι για το ψευδές αρνητικό αποτέλεςμα, πρώτον, σε χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων, όταν τα επίπεδα IgM και IgG είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης αυτής της ταχείας δοκιμής, τα αποτελέσματα της δοκιμής θα είναι αρνητικά. Δεύτερον, η διαφορά στην παραγωγή αντισωμάτων μεμονωμένης ανοσοαπόκρισης μπορεί να είναι ένας λόγος για τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα σε ασθενείς με COVID-19 . Το τελευταίο, αλλά όχι λιγότερο σημαντικό αντίσωμα IgM θα μειωθεί και θα εξαφανιστεί μετά από 2 εβδομάδες. Σε ορισμένες περιπτώσεις, είναι δύσκολο να γνωρίζουμε ακριβώς πότε ο ασθενής έχει μολυνθεί ή πόσο χρονικό διάστημα ο ασθενής έχει μολυνθεί. Έτσι, όταν ο ασθενής δοκιμάστηκε, το επίπεδο IgM θα μπορούσε να είναι κάτω από την αιχμή του και να μην είναι ανιχνεύσιμο από αυτόν τον έλεγχο. Ως εκ τούτου, ενθαρρύνουμε την έρευνα και την ανάπτυξη του συνδυασμένου αντισώματος δοκιμής COVID-19 IgG-IgM για τη βελτίωση της διαγνωστικής ευαισθησίας και της ειδικότητας των ασθενών. Δεδομένου ότι το ανασυνδυασμένο αντιγόνο COVID-19 χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμή, η δοκιμή μας είναι ειδική για τη μόλυνση με COVID-19. Τα δεδομένα κλινικών δοκιμών σε αυτό το έγγραφο σε διαφορετικές κλινικές τοποθεσίες από την ανατολή, νότο, δυτικό και μέσον της Κίνας επιβεβαίωσαν την ιδιαιτερότητα του δοκιμαστικού κιτ. Εντούτοις, εξαιτίας της έκτακτης ανάγκης του COVID-19, δεν μπορούσαμε να πραγματοποιήσουμε κανονικές ερευνητικές δραστηριότητες και να επιτύχουμε αρκετές δοκιμές για να επαληθευτεί εάν υπάρχει παρεμβολή από άλλα IgM και IgG που προκαλούνται από διάφορες λοιμώξεις από ιούς, όπως είναι οι τυπικοί ιοί γρίπης. Αυτή η εργασία πρέπει να γίνει αργότερα. Αυτό το νέο σύντομο SARS-CoV-2IgG-IgM συνδυασμένο test kit  αντισωμάτων έχει αρκετά πλεονεκτήματα. Σε σύγκριση με την RT-PCR, εξοικονομεί χρόνο και δεν απαιτεί εξοπλισμό, είναι απλή στην εκτέλεση και απαιτεί μόνο ελάχιστη εκπαίδευση. Μπορεί να πραγματοποιηθεί στο κρεβάτι, σε οποιαδήποτε κλινική ή εργαστήριο, σε αεροδρόμια ή σε σιδηροδρομικούς σταθμούς [16]. Θα είναι πιο βολικό να χρησιμοποιείτε το αίμα από το δάκτυλο ή τη φτέρνα αντί του φλεβικού αίματος για out-of-clinic προβολή. Τα αρχικά αποτελέσματά μας με τη χρήση του αίματος των δακτύλων ήταν τόσο καλά όσο εκείνα του αίματος των φλεβών (Πίνακας 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα συνδυασμένα πειράματα αντισωμάτων SARS-CoV-2IgG-IgM αναπτύχθηκαν ως παράγοντες για την ταχεία ανίχνευση πεδίου. Μια άλλη πιθανή εφαρμογή αυτού του τεστ είναι η διαλογή ασυμπτωματικών SARS-CoV-2 φορέων, αναφέρθηκε ότι ασυμπτωματικοί φορείς θα μπορούσαν να διαδώσουν ιό SARS-CoV-2. [17,18] Αυτό το εύρημα κατέστησε τον τρέχοντα έλεγχο της επιδημίας COVID-19 πιο δύσκολο, επειδή δεν υπάρχει διαθέσιμη μέθοδος ως ασυμπτωματικοί φορείς. Αυτή η γρήγορη δοκιμασία αντισωμάτων IgM-IgG αντισωμάτων επιτρέπει την εκτεταμένη διαλογή ασυμπτωματικών φορέων. Εντούτοις, τουλάχιστον κάποιοι από τους φορείς δεν είναι πιθανό να έχουν αντι-SARS-CoV-2 αντισώματα, όπως αποδεικνύεται από ασυμπτωματικούς φορείς ιού Zika. [19] Επειδή αυτή η δοκιμασία μπορεί να ανιχνεύσει IgM και IgG ταυτόχρονα, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί τόσο για έγκαιρη διάγνωση (IgM) όσο και για παρακολούθηση κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η μόλυνση από το SARS-CoV-2 ξεκινά από τους πνεύμονες και όχι από την άνω αναπνευστική οδό. Επομένως, η δειγματοληψία κατά τη διάρκεια του πρώιμου σταδίου της μόλυνσης με τη χρήση στυλεού στο λαιμό ή πτύελα μπορεί να μην ανιχνεύσει τον ιό. Αυτή είναι μια πιθανή εξήγηση για τα υψηλά ψευδώς αρνητικά σε δοκιμή PCR με νουκλεϊνικό οξύ. Ωστόσο, αυτό το φαινόμενο δειγματοληψίας δεν πρέπει να έχει καμία επίδραση στην ανίχνευση IgM και IgG με αυτήν την ταχεία δοκιμασία. Με βάση τις γνώσεις και τις πληροφορίες μας, υπάρχουν αρκετές άλλες κινεζικές εταιρείες IVD που αναπτύσσουν ή έχουν αναπτύξει παρόμοια προϊόντα που κυμαίνονται από IgM μόνο και IgM-IgG συνδυασμένες δοκιμές. Δεν γνωρίζουμε τις λεπτομέρειες σχετικά με την τεχνική τους απόδοση, καθώς δεν υπάρχει δημοσίευση για αυτά. Πιστεύουμε ότι τα καλά δοκιμαστικά προϊόντα θα χρησιμοποιηθούν σε κλινικές τοποθεσίες και οι πληροφορίες θα προκύψουν. Οι εξετάσεις αυτές δεν μπορούν να επιβεβαιώσουν την παρουσία ιών, παρέχουν μόνο στοιχεία για την πρόσφατη μόλυνση, αλλά παρέχουν σημαντική ανοσολογική απόδειξη για τους ιατρούς να κάνουν τη σωστή διάγνωση μαζί με άλλες εξετάσεις και να ξεκινήσουν τη θεραπεία των ασθενών. Επιπλέον, η πιθανή διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλους κοροναϊούς και τους ιούς της γρίπης δεν μελετήθηκε και το επίπεδο αλλαγής του αντισώματος δεν συγκρίθηκε στα διάφορα στάδια της μόλυνσης από SARS-CoV-2. Πιστεύουμε ότι ο συνδυασμός RT-PCR νουκλεϊνικού οξέος και IgM- Ανίχνευση IgG αντισωμάτων μπορεί να παρέχει πιο ακριβή διάγνωση SARS-CoV-2 λοιμώξεων.

Συμπέρασμα

Μεταπτυχίσαμε μια σύντομη τεχνική ανοσολογικής ανάλυσης δοκιμαστικών αντισωμάτων SARS-CoV-2 IgG-IgM. Χρειάζονται λιγότερα από 15 λεπτά για να παραχθούν αποτελέσματα και να προσδιοριστεί εάν υπάρχει πρόσφατη μόλυνση με SARS-CoV-2. Είναι εύκολο στη χρήση και δεν απαιτείται πρόσθετος εξοπλισμός. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης κατέδειξαν ότι αυτή η δοκιμή είναι ευαίσθητη και συγκεκριμένη. Αυτή η ταχεία δοκιμή έχει εξαιρετική χρησιμότητα για την ταχεία ανίχνευση των SARS-CoV-2 λοιμώξεων και έχει ήδη δημιουργήσει τεράστιο ενδιαφέρον και αυξημένες κλινικές χρήσεις μετά από σύντομο έλεγχο σε κέντρα υγείας. Αναπνευστική ασθένεια για εξαιρετική βοήθεια. Επιπλέον, ευχαριστούμε επίσης την κυρία Cuiwei Qiu για τη βοήθεια γραπτού περιεχομένου και ο Δρ Alan Schreier για την επεξεργασία αυτού του χειρόγραφου.

 

Καταχώρηση στο pubmed https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32104917

 

To άρθρο δημοσιεύτηκε στο J Med Virol. 2020 Feb 27. doi: 10.1002/jmv.25727

Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.

Li Z1,2Yi Y3,2Luo X4,2Xiong N5,2Liu Y6,2Li S1,2Sun R6,2Wang Y1,2Hu B2,7Chen W2,8Zhang Y4,2Wang J5,2Huang B2,9Lin Y1,2Yang J3,2Cai W2,9Wang X2,9Cheng J1,2Chen Z2,9Sun K2,9Pan W2,9Zhan Z2,10Chen L1,2Ye F1,2.